Bronkhorst

Präzise Durchflussregelung in der Krebsforschung

3. Februar 2020 Prof. dr. Kees Jalink

Wie erhält man Tumorzellen für die Grundlagenforschung am Leben?

„Eines der Hauptziele der grundlegenden Krebsforschung ist es, die Unterschiede zwischen normalen und Krebszellen aufzudecken. Diese Unterschiede könnten dann bei der Jagd nach bestimmten Krebsbehandlungsmöglichkeiten ausgenutzt werden: Jedes Verhalten, das sich ausschließlich auf Krebszellen konzentriert, könnte uns Hinweise geben, wie wir Krebszellen angreifen und gesunde Zellen unberührt lassen können ", erklärt Prof. Dr. Kees Jalink vom Niederländischen Krebsinstitut in Amsterdam.

Heute erzählt Prof. Dr. Kees Jalink seine Geschichte über die Forschung der Biophysics and Advanced Imaging Group', an der das NKI (Niederländisches Krebsinstitut) arbeitet, und über die Rolle von Durchflussmessgeräten und -reglern in ihrer Forschung.

Prof. dr. Kees Jalink Netherlands Cancer Institute
Prof. dr. Kees Jalink (NKI Amsterdam)

Arbeitsgruppe Biophysics and Advanced Imaging am NKI

Die Aufklärung dieser Unterschiede zwischen normalen Zellen und Krebszellen hat sich als schwierige Aufgabe erwiesen, da die meisten Krebszellen zu 99,9% wie gesunde Zellen sind. In der Arbeitsgruppe Biophysics und Advanced Imaging zoomen wir Zellen mit Hilfe fortschrittlicher Mikroskopie-Techniken heran, einschließlich Live-Cell Imaging, Fluoreszenzmikroskopie und "Functional Imaging" -Techniken. In letzterem werden Techniken wie Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) und Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie eingesetzt, um Informationen über Proteine (Biomolekülen) und ihre Wechselwirkungen in einzelnen lebenden Krebszellen zu extrahieren.

NKI composite living cells for Cancer Research
Photo Jalink Group | Lebender Zellverbund NKI

Lebende Zellen liefern mehr Informationen

Vor nicht allzu langer Zeit war es zur Visualisierung durch hochauflösende Mikroskopie notwendig, die Zellen in der Regel zu töten. Anschließend wurden sie fixiert, mit bestimmten Komponenten gefärbt und in Harz eingebettet. Die Bildgebung lebender Zellen liefert jedoch viel mehr Informationen:

  • lebende Zellen können geteilt werden
  • wandern
  • interagieren, um enge Monolagen zu bilden, genau wie lebende (Krebs-)Zellen in unserem Körper.

Nur mit lebenden Zellen können wir die Dynamik der inneren biochemischen Prozesse verstehen.

Eine ganze Reihe von farbigen Fluoreszenzproteinen stehen zur Verfügung, die es uns ermöglichen, eine einzelne Proteinspezies zu markieren und zu erfahren, was wir über dieses Protein wissen wollen. Um die aktive Zelle beobachten zu können ist es natürlich notwendig, diese Zellen auch unter dem Mikroskop am Leben und gesund zu erhalten.

NKI cells through microscope
Eine zweifarbige Mikroaufnahme einiger Zellen durch das Mikroskop

Am Mikroskop werden die Zellen in einer Glasbodenschale aufbewahrt, die mit DMEM-Medium gefüllt ist: einer blutplasmaähnlichen Salzlösung mit Vitaminen und Nährstoffen. Zu Beginn der Untersuchungen haben wir die Zellen in ihren Schalen direkt an freier Luft aufbewahrt (~20 % O2, 80 % N2, 0,05% CO2). Das entspricht jedoch keineswegs der Atmosphäre in unserem Körper, so dass die Ergebnisse nicht unseren Erwartungen entsprachen.

Zum Beispiel haben sich die Zellen nicht geteilt und die meisten Zellen starben nach 1-2 Tagen. Auch die Kontrolle des pH-Wertes im Medium erschien nahezu unmöglich. Deshalb mussten wir einen speziellen Inkubator entwickeln, der sowohl die Zellen in ihrer Petrischale als auch das Mikroskop zum größten Teil umschließt und so die Bedingungen im Körper simuliert.

Im Inneren des Inkubators musste die Temperatur auf 37 °C gehalten werden, die Luft musste befeuchtet werden und auch die Atmospäre selbst musste auf die Bedingungen im Körper angepasst werden:

  • Es sind mindestens 5 % in der Atmosphäre
  • Der Sauerstoffgehalt musste einstellbar sein zwischen ~2 % und 20 %

Dies soll den verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen im Körper ähneln. Zum Beispiel sind solide Tumore bekanntermaßen hypoxisch (enthalten also weniger als ein paar % O2), was die Physiologie der Zellen und ihr Ansprechen auf Krebsmedikamente völlig verändert. Lesen Sie die Prozesslösung in der Application Note unserer Kunden.

Application Note

Aber wie erreicht man eine präzise Regelung der Atmosphäre?

Auf einer Ausstellung lernten wir Bronkhorst und seine Massendurchflussmesser und -regler kennen. Mit Unterstützung von Bronkhorst Niederlande haben wir drei thermische Massendurchflussregler der Serie EL-FLOW Select ausgewählt.

Diese Massendurchflussregler sind an die in unserem Labor vorhandenen Anschlüsse für komprimierte CO2, N2 und Luft angeschlossen. Hiermit ist es möglich, die verschiedenen Sauerstoffanteile im Körper zu simulieren. So ist es zum Beispiel bekannt, dass solide Tumore hypoxisch sind, also weniger als einige Prozent O2 enthalten, was die Physiologie der Zellen und ihre Reaktion auf Krebsmedikamente völlig verändert.
 

bronkhorst uflow flow meter
Bronkhorst-Instrumente im Versuchsaufbau

Der Rest war einfach: Durch die Einstellung der relativen Gasströme mit Hilfe der Massendurchflussregler können wir nun die CO2-, N2- und O2-Werte auf alle relevanten Werte einstellen. Diese Bereiche betragen 2-19 % für Sauerstoff, 0-20 % für CO2 und 80 - 100 % für Stickstoff.

Seitdem haben wir alle unsere Experimente unter solchen kontrollierten Bedingungen durchgeführt und die Ergebnisse sind dank dieses Inkubators viel konsistenter- und auch viel relevanter - gewesen. Wir haben damit untersucht, wie Krebszellen während der Metastasierung wandern und wie sie in Schichten anderer Zellen eindringen und in dieser "Nische" überleben können. Wir nutzten es auch, um zu erforschen, wie Zellen chemische Signale nutzen, um miteinander zu kommunizieren und wie diese Signale empfangen und anschließend in den Zellen im Detail verarbeitet werden.
 

Der µ-Flow Flüssigkeits-Durchflussregler rettet die lebenden Zellkulturen

Wie es in der Wissenschaft häufig läuft, führte die Lösung eines Problems zur Identifikation eines anderen. Wir stellten fest, dass bei 37°C das Medium schneller verdunstete und die Zellen nach einigen Tagen trocken blieben, es sei denn, wir verschlossen die Aufnahmeschale fest. Aber das schränkt den Zugang zu den Zellen ein und macht es unmöglich, während des Experiments Wachstumsfaktoren, Hormone oder Krebsmedikamente für unsere Studien hinzuzufügen.

Die Befeuchtung der Luft löste das nur teilweise, denn bei hoher Luftfeuchtigkeit bildete sich Kondenswasser, das die empfindliche Elektronik in unserem Setup beschädigen konnte, und wir mussten deshalb unter 60 % relative Luftfeuchtigkeit bleiben. Auch hier stellten Massenflussregler eine einfache und zuverlässige Lösung dar. Wir haben einen µ-FLOW Massendurchflussregler für Flüssigkeiten ausgewählt, um einen sehr stabilen Durchfluss von deionisiertem Wasser zu liefern. Mit einem lokalen BRIGHT Controller mit PiPS (Plug-in Power Supply) konnten wir den Wasserzufluss zwischen 0,5 und 9,6 Mikroliter pro Minute kontrollieren.

Empirisch fanden wir heraus, dass wir mit einem Flüssigkeitsdurchfluss von 1,3 µl/min die Verdunstung vollständig kompensiert haben. Damit sind wir nun in der Lage, die Zellen wochenlang auf dem Mikroskop am Leben zu halten. Das System ist sehr wartungsarm: einfach installieren und es läuft, so können wir uns auf unsere Forschung konzentrieren. Die Massendurchflussregler waren bei der Konstruktion des Mikroskop-Inkubators ausschlaggebend, und die Zellen, sie teilen sich und entwickeln sich gut.

The Netherlands Cancer Institute, NKI

   


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